[浅野 謙一]

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 細胞工学|2014年|Vol.33|No.12より

はじめに
　成体のあらゆる臓器に常在するマクロファージは、組織ごとに特徴も機能も異なる多様な亜集団で構成されている。樹状細胞やリンパ球など他の免疫細胞に比べ、マクロファージの分子・遺伝マーカー・機能および局在に基づく分類はこれまであまり進んでこなかった。Metchnikoffによるマクロファージの命名から1世紀以上が経った今日においてもなお、マクロファージは発見者の名や、それが常在する組織にちなんだ細胞名で呼ばれている。サイトカイン遺伝子発現パターンとその機能に基づき、組織障害型のM1マクロファージと、組織修復や炎症収束を担うM2マクロファージに大別する概念(1)が提唱されておよそ10年が経った。この方法はインビトロで分化誘導したマクロファージや、脂肪組織など特定の組織マクロファージには簡便で有用な分類方法であったが、生体においてはいずれにも分類できないマクロファージ亜集団も存在することが分かってきた。したがって現段階においては、常在マクロファージの恒常性維持と疾患誘導における役割を、亜集団毎に解析せざるを得ないと思われる。
　
I　腎虚血再灌流傷害とCD169発現マクロファージ
1. 急性腎傷害(acute kidney injury; AKI)とその病態
　AKIとは、急激な腎機能低下によって体液・電解質・酸塩基バランスを維持できなくなった状態であり、尿毒症症状など腎機能低下に伴う異常を認める状態を意味する(2)。以前は急性腎不全(acute renal failure)と呼ばれていた病態であるが、最近、より軽度の腎機能障害を含めた概念としてAKIが用いられている。尿細管壊死を伴い、原因を除去することで数日で自然回復を期待できるという病理的、臨床的特徴を有する。糸球体病変は一般的に軽度である。虚血再灌流による急性尿細管壊死は、AKIの主要な病因と位置づけられており、近年では移植腎における腎障害の病因としても注目を集めている。一過性の腎虚血とそれに続く再灌流(ischemia-reperfusion; IR)は腎尿細管細胞を傷害し、尿細管壊死や円柱による尿細管閉塞を引き起こす。管腔内に脱落した壊死尿細管細胞などによって形成される尿細管円柱は尿細管内圧を上昇させ糸球体濾過効率を低下させる。さらに尿細管壊死部から原尿が間質へ拡散し、強い腎機能低下が起こる。しかしながらIRが尿細管壊死をきたす分子・細胞学的機序についてはまだあまり分かっていない。

2. 腎虚血再灌流傷害モデルマウス
　マウスの腎虚血再灌流傷害(IR injury; IRI)は簡便で再現性の高い急性腎傷害モデルとしてヒト腎障害の分子メカニズム解明に利用されている(3)。腎血管束を血管クリップで30分〜1時間阻血後、血流を再開通(再灌流)することでIRIを誘導する。片側のみのIRでは対側腎の代償性機能亢進により尿毒症症状は出現しないが、対側腎を摘出することでAKIを誘導できる。IRIの病理所見の解析には片側IRを、AKIによる臨床症状を検討したい場合には両側IR（片側IR+対側腎摘出術）を選択する。野生型マウスの両側IRでは広範な尿細管壊死に伴う尿毒症症状(血清クレアチニン、尿素窒素の上昇)が出現し、術後１日をピークに約2日間で自然回復する。尿細管壊死と炎症細胞浸潤は腎皮質−髄質境界部でもっとも強く、糸球体や皮質にはほとんど病的変化を認めない。

3. 腎髄質尿細管血管束周囲に局在するCD169発現マクロファージ
CD169はsialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins 1(siglec1)とも呼ばれるI型膜タンパクだが特異的内因性リガンドも、定常状態における詳しい機能もまだほとんど分かっていない。CD169分子を発現するマクロファージ亜集団が発見されたのは1986年で(4)、この細胞が機能・局在の両面できわめてユニークな細胞集団であることが急速に明らかになりつつある(5)。例えば脾臓のCD169陽性マクロファージは辺縁帯と呼ばれる血流豊富な領域に局在し、血流中のアポトーシス細胞を捕獲する。そしてCD103陽性樹状細胞と協調して死細胞抗原特異的な自己寛容を誘導する(6,7)。またリンパ節では辺縁洞と呼ばれるリンパの流域に局在し、がん死細胞抗原をCD8T細胞に抗原提示し、がん免疫の成立に寄与する(8)。このように、CD169マクロファージはリンパ組織と外界の境界領域に局在し、抗原の侵入を監視する特殊な細胞集団であると考えられる。
　我々は生体内のCD169発現細胞を可視化するため、CD169遺伝子プロモーターの下流にimproved Cre遺伝子を挿入したマウス(CD169-Creマウス)を作製した(9)。このマウスとRosa26-stop-YFPマウスを交配したマウス（CD169-Cre-YFPマウス）では、CD169遺伝子を一度発現した細胞は、以後CD169分子発現の有無に関わらずYFPを発現し続ける。CD169-Cre-YFPマウスの解析から、上述の脾臓・リンパ節に加え、腎臓を含むさまざまな臓器マクロファージがCD169発現細胞由来なことが判明した。非常に興味深いことに、腎臓におけるYFP(CD169)発現細胞の分布は髄質に限局し、しかもその多くが尿細管血管束周囲に局在することが分かった。汎マクロファージマーカーCX3CR1陽性マクロファージの局在と比較すると、CD169(YFP)発現細胞の髄質への偏在は対照的である。
　腎臓の骨髄系免疫細胞は、CD11bとF4/80の発現レベルの違いにより3分画に分けることができる(10)。このうちCD11b/F4/80二重陽性(double positive, DP)分画にはLy6C陰性,Gr-1陰性,CD11c陽性の常在マクロファージ、CD11b単陽性(single positive, SP)分画にはGr-1陽性好中球とLy6C陽性の単球由来マクロファージが、また二重陰性(double negative, DN)分画にはCD11b陰性の樹状細胞等が含まれる。CD169-Cre-YFPマウスの腎臓では二重陽性分画の約60％がYFP陽性で、その他の分画にはYFP陽性細胞はほとんど存在しなかった。
　ここで我々は、腎臓のYFP（CD169）発現細胞がIR後の尿細管壊死好発部位(皮髄境界部)と共局在することに着目した。CD169マクロファージがIRによる組織傷害に何らかの役割を担うのではないかと考え、このマクロファージ消失時のIRIの病態をCD169-DTRマウスを用いて検討した。CD169-DTRマウスはジフテリア毒素(DT)投与により一過性かつ選択的にCD169陽性細胞を消失できるマウスである(6)。このマウスにDTを投与し、まず腎臓マクロファージのポピュレーションの変化をフローサイトメトリーで検討した。CD169-DTRマウスにDTを投与するとDP分画の常在マクロファージのみが約50％減少(74.6→37.5％)し、4日後には初期状態に回復した。驚いたことに、DT投与後にIRIを誘導したCD169−DTRマウスでは、AKIの重症化により全例が術後3日目までに死亡した。IR後のCD169-DTRマウスの腎臓では、野生型に比べ好中球数が著明に増加したことから、CD169マクロファージは何らかの機序で腎臓への好中球動員を抑制している可能性が示唆された。

II CD169マクロファージによる腎障害増悪機序
　CD169マクロファージによる好中球動員機序を解明するため、まず腎臓におけるケモカインmRNA発現量を検討した。好中球の遊走に関与するケモカインとしてはCXCL1, CXCL2がよく知られている。このうちIR後のCD169-DTRマウスの腎臓では野生型に比べCXCL2遺伝子の発現レベルが有意に上昇していた。しかし、この上昇がCD169マクロファージの消失によるものか、あるいは腎臓の炎症に伴う2次的な上昇か判別しがたいため、さらに血管内皮接着因子のmRNA発現レベルを定量した。するとDT投与CD169-DTRマウスではIRI誘導前(pre-injury)でもICAM-I mRNAが野生型に比べ強発現しており、これがIRI誘導でさらに上昇することが分かった。この結果は、CD169マクロファージが定常状態において血管内皮の活性化を抑制している可能性を強く示唆する。すなわちCD169-DTRマウスではCD169マクロファージの消失により血管内皮ICAM-1が高発現し、それがIR後の好中球集積を促進したと考えられた。

III　CD169マクロファージの免疫制御作用を活用したAKI抑制の試み
　ここまでの結果から、CD169マクロファージは血管内皮のICAM-1発現抑制を通じて好中球の炎症局所への動員を制御している可能性が示された。そこでこれらの知見を活用し、IRI誘導CD169-DTRマウスにおけるAKI増悪を抑制したいと考えた。好中球による組織破壊がCD169−DTRマウスにおけるAKI増悪の直接原因であると考えられたため、抗Gr-1抗体を投与して好中球を消失すると、予想通りIR後の生存率が著明に改善した。ICAM-1に対する阻害抗体投与でも、やはりIRIの予後を改善することができた。
　血液中の単球にはLy6C強陽性(Ly6Chi)と中等度陽性(Ly6Clo)の亜集団があり、前者が傷害組織に選択的に浸潤し炎症を惹起する細胞であるのに対し、後者は一部の組織マクロファージの前駆細胞として、組織の恒常性維持に寄与すると考えられてきた(11)。申請者はFate-map(CD169-Cre-YFP)マウスの解析から、腎臓のCD169マクロファージが単球に由来することを示唆する知見を得た。そこで野生型マウスの末梢血白血球をCD169-DTRマウスに移入し、IRI後のAKI増悪を抑制できるか検討した。Ly6Clo単球を移入したグループではIRIによるAKI劇症化を抑制することができた。予想に反しLy6Chi単球移入マウスでもわずかであるが生存率が改善した。これは移入先のマウスの体内でLy6Chiの単球がLy6Cloに変化した可能性が考えられる(12)。単球移入に伴いCD169-DTRマウスの腎臓でICAM-1発現レベルが低下したことから、CD169マクロファージは血管内皮ICAM-1発現を抑制し、それがIR後の傷害腎への好中球集積を制限することが示唆された。今後、CD169マクロファージが血管内皮の活性化、特に接着因子の発現をどのように制御するのか、詳しい分子学的機序を解明する必要がある。

IV　おわりに
　前述のように、当初2次リンパ組織の常在細胞として見つかったCD169マクロファージは、リンパ臓器以外にも広く全身の臓器に分布することが判明した。CX3CR1陽性の常在マクロファージが、組織内で均一に分布するのに対し、CD169マクロファージは血管やリンパ管の周囲に局在するという特徴を持つ。組織は血液やリンパを介して流入する抗原に絶えず曝されており、このような空間的要衝に位置するCD169マクロファージは、流入する抗原の性質を識別する「センチネル（衛兵）」の役割を担う可能性が示唆される。
　Fate-mappingマウス(CD169-Cre-YFPマウス)の解析から、YFP(CD169)陽性細胞の中に、CD169陰性の細胞集団が存在することが判明した。これらの細胞は分化のある段階でCD169分子を発現しながら、末梢組織移住後に細胞表面のCD169発現を喪失したと考えられる。CD169分子の生体における機能はまだよく分かっていないが、血管周囲への局在と、CD169分子の発現に何らかの時間的・空間的相関があるのかもしれない。
　腎臓間質のCD169マクロファージは血管内皮の過剰な活性化を抑制することで組織の恒常性維持に寄与する。今後この免疫制御機能を応用した腎障害抑制療法の開発が進むことを期待したい。

参考文献
(1) Mantovani, A. et al. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.
　 Trends Immunol 25, 677-86 (2004).
(2) 矢崎義雄　総編：内科学11章, 1510-1516(第10版,朝倉書店,2013).
(3) Eltzschig, H.K. & Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med 17, 1391-401 (2011).
(4) Kraal, G. & Janse, M. Marginal metallophilic cells of the mouse spleen identified by a monoclonal antibody.
Immunology 58, 665-9 (1986).
(5) Martinez-Pomares, L. & Gordon, S. CD169+ macrophages at the crossroads of antigen presentation. Trends Immunol 33, 66-70 (2012).
(6) Miyake, Y. et al. Critical role of macrophages in the marginal zone in the suppression of immune responses to apoptotic cell-
associated antigens. J Clin Invest 117, 2268-2278 (2007).
(7) Qiu, C.H. et al. Novel subset of CD8{alpha}+ dendritic cells localized in the marginal zone is responsible for tolerance to
cell-associated antigens. J Immunol 182, 4127-36 (2009).
(8) Asano, K. et al. CD169-positive macrophages dominate antitumor immunity by crosspresenting dead cell-associated antigens.
Immunity 34, 85-95 (2011).
(9) Karasawa, K. et al. Vascular-resident CD169-positive Monocytes and Macrophages Control Neutrophil Accumulation in the Kidney with
Ischemia-reperfusion Injury. Journal of the American Society of Nephrology (in press).
(10)Li, L. et al. The chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 mediate monocyte/macrophage trafficking in kidney ischemia-reperfusion
injury. Kidney Int 74, 1526-37 (2008).
(11)Carlin, L.M. et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.
Cell 153, 362-75 (2013).
(12)Yona, S. et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis.
Immunity 38, 79-91 (2013).

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